TUNEL-Test: hochsensitiver Nachweis von Apoptose zur Gewährleistung der Zellsicherheit von Kosmetika
Der TUNEL-Test ist eine wichtige Methode zum Nachweis von DNA-Fragmentierung, einem charakteristischen Marker für den programmierten Zelltod oder die Apoptose. Mit ihm lässt sich feststellen, ob ein Inhaltsstoff oder ein Kosmetikprodukt eine übermäßige oder unerwünschte Apoptose in exponierten Zellen auslösen kann, was ein wichtiger Parameter für die Gewährleistung der biologischen Sicherheit von Formulierungen ist.
Die Zellen werden zunächst unter streng kontrollierten Bedingungen, die ihrer tatsächlichen Verwendung entsprechen, mit dem Produkt in Kontakt gebracht. Die während des Apoptosevorgangs entstandenen DNA-Fragmente werden anschließend mit fluoreszierenden oder kolorimetrischen Indikatoren markiert, wodurch die betroffenen Zellen genau sichtbar gemacht werden können. Anhand des Anteils der markierten Zellen und der Signalintensität lässt sich das Ausmaß des beobachteten Effekts bewerten.
Ein hoher Anteil positiver Zellen kann auf ein potenzielles Risiko für die Lebensfähigkeit der Zellen hinweisen, während ein geringer oder kein Anteil die gute Verträglichkeit des Produkts auf dieser biologischen Ebene bestätigt. Dank seiner hohen Sensitivität ist der TUNEL-Test eine ergänzende Methode zu anderen toxikologischen und genetischen Analysen, die in der Schweiz und in Europa zur Validierung der Unbedenklichkeit von Wirkstoffen und innovativen Formulierungen eingesetzt werden.
Der TUNEL-Test (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labelling) ist heute die Referenzmethode zur Identifizierung der DNA-Fragmentierung, einem eindeutigen Marker für den programmierten Zelltod (Apoptose). Im Bereich der Kosmetik ermöglicht sie die Überprüfung, ob ein Inhaltsstoff oder eine Formulierung keine übermäßige Apoptose auslöst, was ein wesentliches Kriterium für die biologische Sicherheit von Produkten für die Haut oder die Schleimhäute ist.
Prinzip des Tests
- Kontrollierte Belichtung – Menschliche Zellen (Keratinozyten, Fibroblasten oder Bindehautzellen, je nach getestetem Produkt) werden mit dem Produkt in Konzentrationen inkubiert, die den tatsächlichen Anwendungsbedingungen entsprechen.
- Markierung von DNA-Brüchen – Die terminale Nukleotidyltransferase (TdT) fügt markierte Nukleotide (Fluorochrome: FITC, Alexa 488; oder kolorimetrische Substrate) an die 3'-OH-Enden der während der Apoptose entstandenen DNA-Fragmente an.
- Erkennung – Die markierten Zellen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet oder mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Prozentsatz der positiven Zellen und die Signalintensität quantifizieren das Ausmaß der induzierten Apoptose.
Warum der TUNEL?
- Hohe Empfindlichkeit : Es erkennt sogar geringe DNA-Fragmentierung, die mit herkömmlichen Lebensfähigkeitstests (MTT, Trypan Blue) oft nicht sichtbar ist.
- Besonderheit : Die Färbung tritt nur auf, wenn die DNA-Stränge tatsächlich durchtrennt sind, wodurch falsch positive Ergebnisse aufgrund oberflächlicher Schäden vermieden werden.
- Einhaltung gesetzlicher Vorschriften : Die Schweizer Behörden (OCos/OSAV) und die europäischen Behörden (Verordnung (EG) Nr. 1223/2009) verlangen eine umfassende Bewertung der Zelltoxizität für Wirkstoffe, insbesondere solche natürlichen oder biotechnologischen Ursprungs.
- Integration in DIP/PIF : Die Ergebnisse (Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen, Dosis-Wirkungs-Kurven) werden direkt in die Produktinformationsdatei (PIF) oder das Produktinformationsblatt (PIF) übernommen und stärken so die Zulassungsunterlagen.